Tutkimusoppaat

Kylmäkuivatun peptidin liuottaminen

Miten kylmäkuivattu peptidi liuotetaan bakteriostaattisella vedellä sitä vahingoittamatta: miksi neste valutetaan injektiopullon seinämää pitkin eikä ravisteta.

Liuottaminen on hetki, jolloin vakaasta kuivasta materiaalista tulee epävakaa liuos. Suurin osa siitä, mikä voi mennä pieleen, menee pieleen ensimmäisen minuutin aikana. Tekniikka ei ole vaikea, mutta moni intuitiivinen liike on väärä: suihkun suuntaaminen kakkuun, ravistelu vauhdittamiseksi, pullon lämmittäminen.

Liuottimen valinta

Bakteriostaattinen vesi on tavanomainen valinta pullolle, joka avataan useammin kuin kerran. Se on steriiliä vettä, jossa on säilöntäaineena 0,9 % bentsyylialkoholia, ja säilöntäaine on koko ero: se estää bakteerien lisääntymisen, joten pullo kestää toistuvat tulpan lävistykset koko käyttöikänsä. Tavallisessa steriilissä vedessä säilöntäainetta ei ole, ja se on kertakäyttöistä.

Liukoisuus puolestaan riippuu sekvenssistä, ja se kannattaa tarkistaa ennen kuin pullo on auki. Useimmat peptidit liukenevat veteen vaivatta. Hyvin hydrofobiset sekvenssit ja ne, joissa on runsaasti happamia tai emäksisiä tähteitä, voivat vaatia toisen reitin: liuota ensin pieneen tilavuuteen sellaista liuotinta, johon peptidi aidosti liukenee, ja laimenna vasta sitten työpuskuriin. Se on parempi kuin taistella kakun kanssa, joka ei suostu liukenemaan veteen.

Liuottimen valinta vaikuttaa siihen, mitä voit mitata. Bentsyylialkoholi on säilöntäaine eikä inertti apuaine, ja se jää lopulliseen liuokseen. Jos sillä on työn kannalta merkitystä, tavallinen steriili vesi ja kertakäyttöinen käsittely on puhtaampi ratkaisu.

Tilavuuden laskeminen

Laskutoimitus on tässä helpoin osa: pitoisuus on pullon ilmoitettu massa jaettuna lisätyn liuottimen tilavuudella. Kun 10 mg:n pullo liuotetaan kahteen millilitraan, pitoisuudeksi tulee 5 mg/ml. Kaksi asiaa kannattaa silti sanoa ääneen. Etiketin massa on analyysitodistuksen mukainen peptidipitoisuus. Ja koska useimmat peptidit toimitetaan suolamuodossa, tyypillisesti asetaattina tai trifluoroasetaattina, nettopeptidipitoisuus ei ole sama asia kuin pullon bruttopaino. Eron ratkaisee analyysitodistus.

Valitse tilavuus, jolla saat otettua tarvitsemasi määrät joutumatta mittaamaan epäkäytännöllisen pieniä tilavuuksia ja jonka ehdit käyttää liuotetun materiaalin käyttöajan sisällä. Niin väkevä liuos, että jokainen mittaus osuu ruiskun mitta-alueen alarajalle, tuo enemmän virhettä kuin säästää.

Tekniikka

  • Anna sekä pullon että liuottimen lämmetä huoneenlämpöisiksi. Kylmään lasiin lisätty kylmä vesi hidastaa liukenemista, ja kosteutta tiivistyy aina kun jotain avataan.
  • Pyyhi kumitulppa alkoholipyyhkeellä ja anna sen kuivua. Sisään mennään tulpan läpi eikä lasin, ja sitä kautta kulkee myös kontaminaatio.
  • Suuntaa suihku pullon seinämään äläkä kakkuun. Suoraan kakkuun osuva vesi painaa sen paakuksi, joka liukenee hitaasti ja voi jättää ilmaa sisäänsä. Seinämää pitkin valuva vesi liuottaa kakun alta päin.
  • Lisää liuotin hitaasti. Yhdellä työnnöllä tyhjennetty ruisku tekee saman kuin kakkuun tähtääminen.
  • Pyöritä varovasti, älä ravista. Ravistelu sekoittaa ilmaa liuokseen, ja peptidit denaturoituvat ja aggregoituvat juuri ilman ja nesteen rajapinnalla. Vaahto pullossa kertoo, että niin on jo käynyt.
  • Odota. Osa kakuista liukenee sekunneissa, osa vaatii useita minuutteja silloin tällöin toistettua varovaista pyöritystä. Kärsivällisyys ei maksa mitään; lämpö ja voimakas sekoittaminen maksavat puhtautta.

Valmiin liuoksen kuuluu olla kirkas ja vailla näkyviä hiukkasia. Jos liuos on samea tai siinä on ainesta, joka ei liukene varovaisesti pyörittämälläkään, jokin on vialla: joko peptidi ei liukene valittuun liuottimeen tai se on aggregoitunut. Kannattaa pysähtyä selvittämään kumpi eikä jatkaa.

Heti liuottamisen jälkeen

Yksi asia kannattaa tehdä heti eikä myöhemmin: merkitse pullo. Liuotuspäivä, pitoisuus ja käytetty liuotin suoraan pulloon. Jääkaapissa, jossa on kolme merkitsemätöntä pulloa, ei ole yhtään käyttökelpoista pulloa, ja liuotuspäivä on ainoa tieto, jota ei voi jälkikäteen päätellä mistään.

Liuotettu materiaali menee 2–8 °C:seen eikä pakastimeen. Säilyvyysartikkeli kertoo miksi ja kuinka pitkästä ajasta on kyse.

Usein kysyttyä

Millä vedellä peptidi liuotetaan?
Bakteriostaattisella vedellä silloin, kun pullo avataan useammin kuin kerran: siinä oleva 0,9 % bentsyylialkoholi estää bakteerien kasvun avausten välillä. Tavallisella steriilillä vedellä silloin, kun avaus on kertaluonteinen tai kun säilöntäaine häiritsisi työtä.
Kuinka paljon vettä pulloon lisätään?
Sen verran, että pitoisuus on tarkasti mitattavissa ja ehdit käyttää liuoksen sen käyttöajan sisällä. Pitoisuus on pullon massa jaettuna liuottimen tilavuudella. Vakiotilavuutta ei ole, ja etiketti ilmoittaa pullon sisällön eikä laimennusta.
Miksi peptidipulloa ei saa ravistaa?
Ravistelu sekoittaa ilmaa liuokseen, ja peptidit denaturoituvat ja aggregoituvat ilman ja nesteen rajapinnalla. Vaahtoaminen on siitä näkyvä merkki. Varovainen pyöritys liuottaa kakun yhtä hyvin eikä synnytä rajapintaa.
Kakku ei liukene. Mitä nyt?
Pysähdy ennen kuin lisäät liuotinta tai lämpöä. Useimmat hitaat kakut ratkeavat sillä, että pyörittelee varovasti muutaman minuutin ajan. Todellinen liukenemattomuus tarkoittaa yleensä, että sekvenssi tarvitsee toisen liuottimen päästäkseen liuokseen ennen laimennusta työpuskuriin. Se on sekvenssin ominaisuus eikä vika pullossa.
Onko bakteriostaattinen vesi sama asia kuin steriili vesi?
Ei ole. Molemmat ovat steriilejä, mutta vain bakteriostaattisessa vedessä on säilöntäaine, 0,9 % bentsyylialkoholia, ja juuri se tekee pullon avaamisesta useammin kuin kerran mahdollista. Näitä kahta vertaillaan omassa artikkelissaan.

Käsitellyt yhdisteet

Kunkin artikkelissa käsitellyn yhdisteen hakemistosivu.

Aiheeseen liittyvät artikkelit

Kaikki oppaat